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蛋白质芯片生物传感器系统(2)
    时间:2011-6-14     点击率:28298

    

      编者按:力学研究所国家微重力实验室靳刚研究员主持的研究团队,在中国科学院知识创新工程项目和国家自然科学基金的资助下,研制成功了“蛋白质芯片生物传感器系统”及实用化样机。该项成果获得了2007年度北京市科技进步三等奖,本文将对这项新技术进行简要的介绍。



    蛋白质芯片生物传感器系统(2)
   
-- 蛋白质芯片是如何工作的?



        靳刚研究员从提出概念开始,和课题组成员们一起,经过多年共同努力,解决了工作原理、方法学构建、试验装置实现和生物医学应用等环节所遇到的一系列科学和技术问题,成功地发展了以蛋白质芯片为靶分子敏感元件的无标记蛋白质芯片生物传感器。该项目经中国科学院鉴定认为达到国际先进水平,并被国际生物光子学杂志以国际新闻形式报道,靳刚也多次在国际会议上作特邀报告。其创新点在于:(1)设计并提出全新概念的无标记光学蛋白质芯片,研制了集蛋白质溶液输运、蛋白质芯片的制备,配基组装、清洗、封闭及蛋白质相互作用等一系列步骤与反应于一身的48单元自动化微流道反应器系统;(2)发展了基于椭偏光学成像技术的蛋白质芯片检测系统,实现同时检测48通道的样品;(3)研究了多种配基的定向组装的芯片表面改性技术;(4)建立了蛋白质数据库框架。
        现在,就让我们来看看这种生物传感器是如何工作的吧!
   


    图1 生物活性探针示意图


        前面的文章已经讲过,蛋白质芯片生物传感器的基本原理是将具有生物活性的生物分子作为感应分子(即配基)装配在固体载体的表面上,形成生物活性感应膜层。科学家常常把它称为生物活性探针(见图1所示)。当感应表面与含有目标分子(就是需要被检测的分子)的溶液接触时,如果溶液中的目标分子与探针上的配基分子之间发生特异性结合,就会生成生物分子复合物。这样,固体表面上的生物分子面密度便发生变化,此变化可以通过椭偏光学成像系统高分辨地观测到,科学家则根据该变化来判定溶液中是否含有能够与配基分子发生特异性结合的目标分子。图1中不仅给出了生物活性探针结构的示意,还给出了检测以及图像的结果。这里所谓的“多元”蛋白质芯片,实质上就是根据芯片设计和配基的定向装配,将多个不同的生物活性探针以阵列式集成在同一个基底上,每一个蛋白质阵列微单元对应一种生物活性探针,由此形成新型多元蛋白质分析技术。靳刚课题组所发展的光学蛋白质芯片生物传感器具有如下特点:
    1) 检测结果直观,全部以图像形式给出,可以鉴别伪信号,并可以提供各种待测蛋白质与配基相互作用的定量结果。
    2) 发展了生物化学表面改性方法,改变了表面的微观结构特性,达到配基的有效固定并保持其生物活性,提高生物分子相互作用检测灵敏度,抑制非特异信号的干扰等。
    3) 蛋白质溶液输运、蛋白质芯片的制备与蛋白质相互作用均在同一微流道蛋白质反应器系统内实现,检测时间从小时降至几分钟,样品消耗仅10微升量级,检测灵敏度优于1纳克/毫升。
    本文仅简要介绍一下所述的微流道蛋白质反应器系统(图2),是生物芯片技术的一个核心部件,它涉及加样、反应、清洗等过程。
 

    

图2 48单元微流道蛋白质芯片反应器的实验样机与控制部分
 

        传统生物芯片的加样方式主要是点样仪。根据点样方式的不同分为两类:第一类是接触式,首先用点样针蘸取待用的配基,然后通过接触芯片表面把配基“点”在芯片上;第二类是喷印式,首先用空心点样针吸取少量的配基,然后通过类似喷墨打印机的方式把配基加到芯片表面上。这两种方式的共同缺点是单个点内配基分子的面密度分布不均匀,显然这将严重影响检测结果的质量,并很难定量化。新一代的生物芯片大多采用整体反应方式,就是把芯片整个浸泡在待测样品溶液中进行反应。这种方法需要的样品量较多,反应时间较长,灵敏度不高。更新的一种芯片加样和反应技术是微流道技术,目前普遍使用的微流道技术的芯片是一体化的,即芯片与微流道是制作在同一块材料上。这种方法所使用的微流道为一次性使用,由于微流道制作复杂且成本较高,从而使得应用受到限制。
        靳刚的研究团队根据多元蛋白质芯片微阵列的特点,设计和研制了12-48单元光学蛋白质芯片制备和反应的微流道系统,可以克服现有技术的缺点。它提供一种集生物芯片制作以及在所制作的生物芯片上直接进行生物分子固定和检测反应的一体化的装置,大幅度地降低了生物芯片的制作成本并简化了生物分子固定和检测反应的操作,还可以重复使用,显示了优异的可应用性。在研制过程中,他们采用了多种微加工技术,包括:数控机床的微加工技术、厚胶工艺的软光刻技术、等离子溅射技术和激光微加工技术。图3A为微流道模板示意图,其表面上制作出呈阵列排列的凹槽,每个凹槽两端开通孔,分别作为液体进口和出口。微流道模板带凹槽的面扣在芯片上, 凹槽与芯片之间形成一个个空腔。将一块开有通孔的刚性材料块安装在微流道模板上, 该通孔与微流道模板的通孔相通,且孔的大小相同;另一块刚性材料块2安装在芯片下面, 利用两块刚性材料块上所镶嵌的磁铁极性相反,在磁力的作用下,将微流道模板上的凹槽与光滑的芯片表面夹在中间,形成一个个空腔, 即形成了有一进一出微流道。刚性材料块的通孔中还可安装一根微管,微管与微量泵连通(图3B)。当需要将某些进出口相连时,可以采用另一块微流道模板2, 其上开有通孔,通孔的位置和个数根据需要设定。该微流道模板2带凹槽的面扣在带通孔的刚性材料2上, 微流道模板2上的通孔分别与刚性材料块3上的液体进口和液体出口连通,微流道模板2的凹槽将刚性材料块2的其余液体进口和液体出口连通,形成一进一出微流道(如图3C所示)。液体进口和出口分别安装一根微管,微管与微量泵连通。实现微流道间的串联后,通过微量泵把待测溶液经通孔送入第一个凹槽,接着待测溶液就会依次流经所有被串联的凹槽,从最后一个凹槽的出口流出。该系统提供了集蛋白质芯片制作、以及在所制作的芯片上即时直接进行生物分子固定和检测反应的方法,还可以通过泵输送缓冲液清洗芯片表面和微流道。待反应完成后,取下芯片,采用常规方法进行结果检测,检测完毕将该装置恢复到图3B所示状态,就可再重复使用。


    

    A 微流道模板


   
 
B 每个微流道含一进出口时结构示意图


   
 
C部分微流道串联时的结构示意图

    图3 微流道结构示意图


        靳刚课题组研制的微流道蛋白质反应器系统具有如下优点:1)集蛋白质芯片封装、制作和反应于一身,结合了微流控芯片和微阵列芯片二者的优势,实现了在同一微系统中进行蛋白质溶液输运、蛋白质芯片的制备与生物分子反应,能够实现多达48单元的蛋白质芯片制作及蛋白质相互作用;2)改变了传统阵列式生物芯片每次仅能检测单种样品的反应模式,实现了利用一片蛋白质芯片同时进行多指标多样品的检测,通过串联方式使微量的样品能够同所有单元进行反应,节约了待测溶液的用量;3)与传统的整体静态的反应模式相比,微流道的流动控制实现了蛋白质芯片主动式反应,有效缩短了反应时间(从小时降至几分钟),显著降低了样品消耗(降低了3个量级),提高了检测灵敏度(从微克量级提高到纳克量级);4)芯片上配基生物分子固定的单元区域是严格由凹槽限定的,固定和反应后的表面再经过缓冲液冲洗,使得制作的芯片上单元的大小和单元内的生物分子面密度均匀一致,加样量和单元面积的大小可控,能够有效提高检测质量。5)制备完成的蛋白质芯片可以封装在微流道系统中的缓冲液环境中,避免暴露于干燥环境中导致蛋白质失活,该装置可以经洗涤干净后重复使用,有效降低了芯片的使用成本。
        微流道蛋白质反应器系统这一高新技术的研发成功,是融合了微流体力学、微电子学以及生物学、物理学、化学等科学的进展,是多学科交叉的成果。

                                                                                      (王柏懿撰文)